การคัดแยกและการเพาะเลี้ยงไซยาโนแบคทีเรียจากถ้ำเขาหินปูนในประเทศไทยเพื่อผลิตไฟโคบิลิโปรตีนและการประเมินฤทธิ์ทางชีวภาพ
By Kittakorn Limrujiwat
Year 2021
บทคัดย่อ
ไฟโคบิลิโปรตีนเป็นโปรตีนเชิงซ้อนสำหรับเก็บเกี่ยวแสงพบได้บนเยื่อหุ้มไทลาคอยด์ของไซยาโนแบคทีเรียซึ่งสามารถดูดซับแสงและถ่ายโอนพลังงานไปยังระบบการสังเคราะห์ด้วยแสงของเซลล์ได้ ปัจจุบันมีการรายงานว่าไฟโคบิลิโปรตีนที่ได้จากไซยาโนแบคทีเรียจัดเป็นผลิตภัณฑ์ธรรมชาติที่มีมูลค่าสูง ซึ่งได้รับความสนใจในการนำไปใช้ประโยชน์ใช้ในอุตสาหกรรมต่าง ๆ เช่น อุตสาหกรรมยา อาหารสัตว์ และเครื่องสำอาง เป็นต้น ประเทศไทยมีพื้นที่ถ้ำเขาหินปูนกระจายอยู่เกือบทั่วทุกภูมิภาคของประเทศ สภาพแวดล้อมของถ้ำเขาหินปูนถูกพบว่ามีลักษณะที่จำเพาะและเป็นสภาวะวิกฤต คือ มีปริมาณแสงธรรมชาติน้อย และมีความชื้นสูง มีสารประกอบแคลเซียมคาร์บอเนตเป็นองค์ประกอบหลักและบางพื้นที่มีปริมาณสารประกอบฟอสฟอรัสและไนโตรเจนสูงเนื่องจากมูลของสัตว์ที่อาศัยอยู่ในถ้ำ ด้วยเหตุนี้จึงทำให้ถ้ำเขาหินปูนเป็นเป็นพื้นที่ที่น่าสนใจในการศึกษาความหลากหลายของไซยาโนแบคทีเรีย
โดยงานวิจัยนี้มุ่งเน้นการศึกษาความหลากหลายของไซยาโนแบคทีเรียจากถ้ำเขาหินปูนในประเทศไทยเพื่อผลิตไฟโคบิลิโปรตีน โดยการเก็บตัวอย่างมาจากถ้ำเขาหินปูนทั้งหมด 23 ถ้ำ จากการศึกษาลักษณะสัณฐานวิทยา พบว่าสามารถคัดแยกสายพันธุ์ไซยาโนแบคทีเรียได้ทั้งหมด 86 สายพันธุ์ จาก 12 สกุล และพบว่าสกุล Leptolyngbya sp. มีสายพันธุ์ที่พบได้มากสุดในตัวอย่างถ้ำเขาหินปูน ตัวอย่างที่คัดแยกทั้งหมดสามารถผลิตไฟโคบิลิโปรตีนได้ และมีไซยาแบคทีเรีย 6 สายพันธุ์ ได้แก่ Leptolyngbya sp. SCOM01, Phormidesmis sp. RK02, Leptolyngbya sp. SWL01, Scytolyngbya sp. LKK05, Leptolyngbya sp. LKK14 และ Nostoc sp. SW02 สามารถผลิตไฟโคบิลิโปรตีนได้มากกว่า 400 มิลลิกรัมต่อกรัมโปรตีน ดังนั้น ทั้ง 6 สายพันธุ์ถูกนำไปยืนยันสายพันธุ์ด้วยเทคนิคทางชีวโมเลกุล และใช้เครื่องมือทางชีวสารสนเทศศาสตร์ในการศึกษาสายสัมพันธ์เชิงวิวัฒนาการของไซยาโนแบคทีเรีย ทำการขยายขนาดการผลิตและศึกษาคุณสมบัติและความบริสุทธิ์ของไฟโคบิลิโปตีนต่อไป
ผลการทดลองพบว่า ไฟโคบิลิโปรตีนทั้งหมดที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์แสดงคุณสมบัติความสามารถในการดูดกลืนคลื่นแสงและความคงตัวที่แตกต่างกัน โดยไซยาโนแบคทีเรีย Nostoc sp. SW02 ให้ผลผลิตไฟโคบิลิโปรตีนสูงสุดคิดเป็นร้อยละ 31.92 และมีอัตราส่วนชนิดไฟโคอิริทรินต่อไฟโคไซยานินต่อออโลไฟโคไซยานิน เท่ากับ 3.4: 1.9: 1.0 นอกจากนั้น สารสกัดไฟโคบิลิโปรตีนจาก Nostoc sp. SW02 ยังแสดงคุณสมบัติการมีฤทธิ์ทางชีวภาพที่น่าสนใจ โดยมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระชนิด DPPH ที่ IC50 เท่ากับ 30.56 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร สารสกัดไฟโคบิลิโปรตีนนี้ยังสามารถยับยั้งเชื้อแบคทีเรียก่อโรคได้โดยมีค่า MIC ของสารสกัดที่ความเข้มข้น 1000 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร รวมทั้งสามารถยับยั้งเซลล์มะเร็งปากมดลูก (Hela) โดยมีค่า IC50 เท่ากับ 140 ไมโครกรัมต่อมมิลลิลิตร เมื่อบ่มเซลล์มะเร็งกับสารสกัดไฟโคบิลิโปรตีนเป็นเวลา 72 ชั่วโมง โดยที่ความเข้มข้นนี้ไม่ส่งผลความเป็นพิษต่อเซลล์ผิวหนังปกติ ดังนั้น จากผลงานวิจัยนี้สามารถช่วยทำให้ทราบข้อมูลความหลากหลายทางชีวภาพของไซยาโนแบคทีเรียในพื้นที่ถ้ำเขาหินปูนของประเทศไทย ตลอดจนไซยาโนแบคทีเรียที่คัดแยกถือได้ว่าเป็นแหล่งใหม่สำหรับผลิตได้ไฟโคบิลิโปตีนที่มีศักยภาพในการนำไปประยุกต์ใช้ประโยชน์ต่อไป
ABSTRACT
Phycobiliproteins are light-harvesting protein complexes found on cyanobacteria’s thylakoid membranes which absorb light and transfer it to the photo system. Nowadays, phycobiliproteins are highly valuable natural products produced by cyanobacteria. Their use in a variety of industries such as pharmaceuticals, feed, and cosmetics has garnered attention. Thailand has many karst cave areas spread throughout the country that are considered distinct extreme environments due to their low natural lighting and high humidity. In these karst cave areas, calcium carbonate and compounds of phosphorus and nitrogen result from the excrement of animals. Therefore, this is an ideal environment to study cyanobacteria biodiversity.
This study examined the production of phycobiliproteins by cyanobacteria from Thailand karst caves. Samples were taken from 23 karst caves and all morphotype isolates were identified as 86 species from 12 genera. Those species were the Leptolyngbya sp. which are commonly found in karst cave samplings. All isolates could produce phycobiliproteins and six cyanobacterial strains, including Leptolyngbya sp. SCOM01, Phormidesmis sp. RK02, Leptolyngbya sp. SWL01, Scytolyngbya sp. LKK05, Leptolyngbya sp. LKK14, and Nostoc sp. SW02 could produce phycobiliprotein content above 400 mg g protein-1. These six strains have been identified using molecular techniques and bioinformatics tools for phylogenic tree analysis. Additionally, production has been scaled up and analyzed for phycobiliprotein properties and purity.
The results of this research showed that all purified phycobiliproteins exhibited distinct spectral characteristics and stabilities as the greatest yield of phycobiliprotein (31.92%) was obtained from cyanobacterium Nostoc sp. SW02, in which the ratio of phycoerythrin: phycocyanin: allophycocyanin was 3.4: 1.9: 1.0. The extracted phycobiliprotein from Nostoc sp. SW02 showed some interesting properties of biological activities such as DPPH antioxidant activity at IC50 value was 30.56 μg mL-1. The inhibition of bacterial pathogens with the MIC values of phycobiliproteins extracted at a concentration of 1,000 μg mL-1 as well as the inhibition of Hela cancer cells by the IC50 value was 140 μg mL-1 when incubated with PBPs extract for 72 h without cytotoxicity on normal cell line. The results show that the biodiversity of cyanobacteria in karst caves of Thailand including isolated cyanobacteria could be considered as a new source for phycobiliprotein with potential for further applications.